El principi de funcionament d'una pipeta Pasteur es basa principalment en el flux-gravetat i l'acció capil·lar, combinada amb el control manual dels diferencials de pressió de l'aire per facilitar l'aspiració i la transferència de líquids.
Control manual d'aspiració: l'operador aplica la succió a l'extrem ample de la pipeta-per via oral o utilitzant una bombeta de goma auxiliar-per crear pressió negativa dins del tub i, d'aquesta manera, treure líquid a la punta fina.
Dispensació per gravetat-: un cop s'allibera la succió, el líquid flueix de manera natural sota la influència de la gravetat; La dispensació també es pot assistir apretant suaument el cos de la pipeta o inclinant el recipient receptor.
Reproductibilitat de gotes: en calibrar la proporció de "gotes per mil·lilitre", la pipeta permet una transferència quantitativa aproximada, la qual cosa la fa adequada per a procediments que requereixen repetibilitat en lloc de precisió absoluta.
Garantia d'esterilitat: abans d'utilitzar-lo, es pot inserir un tap de cotó a l'extrem ample i esterilitzar-lo per evitar la contaminació microbiana durant la manipulació-una pràctica especialment habitual en experiments microbiològics.